Quy trình kiểm soát chất lượng trong sản xuất thức ăn thủy sản

Kiểm soát chất lượng trong ngành công nghiệp sản xuất thức ăn hỗn hợp không chỉ bao gồm việc kiểm tra các tiêu chuẩn chất lượng đã được thiết lập cho từng nguyên liệu khi được tiếp nhận và lưu kho tại nhà máy, mà còn bao gồm việc giám sát chặt chẽ chất lượng nguyên liệu trong suốt quá trình lưu trữ trước khi sử dụng và trong quá trình chế biến. 

Việc kiểm soát chất lượng vẫn tiếp tục khi các nguyên liệu được trộn lẫn trong quá trình phối trộn và sau cùng là khi chúng được lưu trữ dưới dạng thức ăn hỗn hợp thành phẩm.

1. Quy trình kiểm soát chất lượng

1.1 Đối với nguyên liệu thô

Các doanh nghiệp sản xuất thức ăn tại các nước đang phát triển thường hoạt động trong điều kiện khó khăn hơn so với các nước phát triển. Ngoài các vấn đề về tài chính, quản lý và chuyên môn kỹ thuật, việc tiếp cận nguồn nguyên liệu đầy đủ thường rất khó khăn. Sự lựa chọn nguyên liệu thường bị giới hạn chủ yếu vào các loại thức ăn sản xuất trong nước vì chính phủ không muốn sử dụng nguồn ngoại tệ khan hiếm để nhập khẩu. 

Giá cả và mức độ sẵn có của nguyên liệu sản xuất trong nước thường biến động theo mùa và chất lượng cũng có thể thay đổi lớn. Các nguyên liệu nhập khẩu thường được thực hiện qua các đại lý ít có kinh nghiệm hoặc trách nhiệm đối với chất lượng thực tế của hàng hóa. Do đó, nhu cầu kiểm soát chất lượng nguyên liệu và thành phẩm ở các nước đang phát triển là rất cao.

Mục đích của việc kiểm soát chất lượng nguyên liệu là để đảm bảo đáp ứng các tiêu chuẩn tối thiểu theo hợp đồng. Cụ thể hơn, nó cung cấp thông tin về thành phần chính xác của nguyên liệu và mức độ các chất độc hại có thể có để đảm bảo thức ăn hỗn hợp được phối trộn an toàn và có giá trị dinh dưỡng cần thiết. 

Các tiêu chuẩn này thường do nhóm chuyên gia gồm chuyên gia dinh dưỡng, nhân viên quản lý và quản lý chất lượng thiết lập. Các tiêu chuẩn này liên quan đến chất lượng dinh dưỡng, chi phí và chất lượng mong muốn của nguyên liệu. Sau khi đã được thiết lập, các tiêu chuẩn này phải được tuân thủ nghiêm túc. Quyết định về tiêu chuẩn cần phải thực tế: tiêu chuẩn quá chặt sẽ gây khó khăn trong việc mua hàng, còn tiêu chuẩn quá lỏng sẽ ảnh hưởng đến công thức thức ăn.

Phần lớn các loại thức ăn chăn nuôi hiện đại được xây dựng công thức bằng máy tính, nhằm tối ưu chi phí từ các nguyên liệu có sẵn trong khi vẫn đảm bảo các chỉ tiêu về dinh dưỡng, độ độc và độ ngon miệng. Việc này chỉ có thể thực hiện hiệu quả nếu thành phần của từng nguyên liệu được biết chính xác và việc kiểm soát chất lượng được thực hiện tốt.

Đối với nguyên liệu thô, quy trình kiểm soát chất lượng gồm bước sau:

Bước 1. Kiểm tra sơ bộ

Nguyên liệu khi nhập kho cần được kiểm tra kỹ lưỡng về mặt vật lý để xác định:

• (a) Có bị ướt hay không – nấm mốc là dấu hiệu xác nhận nguyên liệu bị ẩm.
• (b) Có lẫn tạp chất như kim loại vụn, đá, đất hay các chất không sinh học khác.
• (c) Có sự hiện diện của côn trùng.

Độ ẩm của các loại hạt dùng làm thức ăn nên được kiểm tra bằng các phương pháp nhanh hiện có trên thị trường. Các lô hàng có độ ẩm vượt quá 13% rất dễ bị mốc và côn trùng tấn công, cần được tách riêng khỏi các nguyên liệu khác. Tốt nhất là chỉ nên đưa nguyên liệu có độ ẩm cao vào kho sau khi đã được sấy khô.

Bước 2. Lấy mẫu

Lấy mẫu là hoạt động quan trọng nhất trong kiểm soát chất lượng, vì không có phân tích nào tốt hơn chính mẫu mà nó đại diện. Do đó, cần phải tuân thủ các quy trình lấy mẫu đúng cách để đánh giá chất lượng một cách đại diện.

• Đối với nguyên liệu đóng bao: dùng que lấy mẫu xuyên chéo, càng ngang càng tốt, từ góc này sang góc kia của bao. Với lô hàng từ 1–10 bao, lấy mẫu toàn bộ. Lớn hơn, lấy mẫu 10% số bao.
• Đối với hàng rời: dùng xẻng lấy mẫu theo tỷ lệ: dưới 10 tấn thì lấy 2 mẫu/tấn, từ 10–100 tấn thì lấy 1–2 mẫu/tấn tùy kích thước lô hàng.

Mẫu sau khi lấy cần trộn đều và chia nhỏ theo phương pháp chia tư để còn khoảng 1–2 kg.

• Với nguyên liệu thô như bánh dầu: lấy ngẫu nhiên 5 mẫu mỗi tấn, nghiền, trộn đều và chia như trên.

Mẫu gửi đến phòng kiểm tra chất lượng phải được đựng trong vật chứa kín khí. Trước khi phân tích, cần xay nhỏ bằng cối xay.

Bước 3. Xét nghiệm

Với các nguyên liệu vừa cung cấp đạm vừa cung cấp năng lượng, thường tiến hành phân tích “Weende” để xác định: độ ẩm, protein thô, lipid, xơ thô, tro và chiết xuất không chứa nitơ.

>>> Xem thêm Chi Tiết Các Bước Phân Tích Chất Xơ Thô Bằng Phương Pháp Wendee  

Nguyên liệu có hàm lượng tro cao cần xét nghiệm tro không tan trong axit để đánh giá lượng đất cát. Điều này cũng giúp phát hiện gian lận trong nguyên liệu đắt tiền như bột cá. 

Phân tích muối (NaCl) trong bột cá giúp phát hiện natri quá mức trong khẩu phần.

Canxi và photpho cần được xác định trong các loại nguyên liệu khoáng như bột xương, canxi photphat và canxi cacbonat. Cả bột cá và bột thịt xương cũng được kiểm tra hai khoáng chất này.

Bước 4. Làm các xét nghiệm khác

Một số loài thủy sản yêu cầu hàm lượng và chất lượng protein cao. Xét nghiệm acid amin như lysine là cần thiết, dù quá trình phức tạp và tốn kém.

Một số nguyên liệu có chứa độc tố tự nhiên: có thể làm chậm tăng trưởng hoặc gây chết nếu hàm lượng cao như:

• (a) urease: enzyme trong đậu nành sống, gây độc thông qua thủy phân ure thành amoniac độc. Được loại bỏ trong quá trình nướng chín.
• (b) gossypol: độc tố trong hạt bông, trừ khi hạt là giống không tuyến hoặc xử lý đặc biệt.
• (c) isothiocyanates: có trong hạt lanh và sắn, thường được loại bỏ trong quá trình chế biến.
• (d) aflatoxin: độc tố cực mạnh do nấm Aspergillus flavus tạo ra, thường có trong bánh dầu lạc, cám dừa, bã cọ và ngô nếu bảo quản kém sau thu hoạch.

Mật mía: nguyên liệu phổ biến vùng nhiệt đới – cần kiểm tra định kỳ lượng đường. Mật mía đôi khi chứa quá nhiều kali.

Chất béo: dễ bị oxy hóa trong khí hậu nhiệt đới, gây mùi ôi. Cần kiểm tra acid béo tự do trong bánh ép như dầu cọ, bã cọ và cám dừa. Dầu cọ chưa tinh luyện hoặc cặn dầu cọ thường chứa nhiều acid béo tự do.

Khoáng vi lượng và vitamin: nếu mua từ nguồn đáng tin cậy thì không cần kiểm tra thường xuyên, trừ khi mua số lượng lớn. Nên gửi mẫu đến phòng thí nghiệm thương mại có uy tín để tiết kiệm chi phí đầu tư thiết bị.

1.2. Đối với các sản phẩm hoàn chỉnh (cám thành phẩm)

Kiểm soát chất lượng sản phẩm cuối cùng nhằm xác định quy trình sản xuất có đảm bảo nguyên liệu được trộn đúng tỷ lệ hay không. Qua đó phát hiện sự không đồng nhất hoặc tách biệt không mong muốn của nguyên liệu. Nếu nguyên liệu đạt tiêu chuẩn và quy trình sản xuất được kiểm soát tốt, thì chỉ cần kiểm tra định kỳ sản phẩm cuối cùng.

Quy trình trải qua 3 bước:

Bước 1. Kiểm tra sơ bộ

Các nhà máy hiện đại thường có sàng và nam châm trên dây chuyền để loại bỏ kim loại, đá và tạp chất. Nhà máy nhỏ nên kiểm tra vật lý sản phẩm để phát hiện tạp chất. Nếu phát hiện, cần báo cho quản lý nhà máy xác định nguyên nhân do nguyên liệu hay bảo trì thiết bị không đúng.

Bước 2. Lấy mẫu

Để phát hiện sự không đồng đều của sản phẩm, nên lấy một nắm tay từ mỗi bao thứ 5 trong lô 40–50 bao, sau đó gộp lại. Tốt nhất là dùng que thăm để lấy mẫu từ đáy, giữa và trên của bao. Có thể phân tích riêng từng mẫu hoặc trộn rồi phân tích, tùy mục đích.

Cỡ mẫu chỉ cần 0,5–1,0 kg (nhỏ hơn nguyên liệu thô).

Mẫu phải được chứa kín khí khi gửi đi phân tích hóa học.

Bước 3. Làm các xét nghiệm cần thiết

Thức ăn thường được giao ngay trong ngày sản xuất hoặc trước khi có kết quả phân tích. Vì vậy, việc kiểm soát nguyên liệu là cực kỳ quan trọng. Tuy nhiên, kiểm soát chất lượng sản phẩm cuối cùng vẫn cần thiết để:

• (a) kiểm tra quy trình sản xuất;
• (b) xác minh chất lượng theo công bố sản phẩm.

Nếu kiểm soát nguyên liệu và quy trình tốt, thì sản phẩm cuối cùng chỉ cần kiểm tra định kỳ độ ẩm và protein thô. Các thành phần khác trong phân tích “Weende” nên được kiểm tra theo định kỳ.

2. Lưu trữ nguyên liệu thô và thức ăn thành phẩm

Cả nguyên liệu thô và thức ăn thành phẩm đều trải qua các thay đổi làm giảm chất lượng trong quá trình lưu trữ. 

• Đối với nguyên liệu thô, những thay đổi này gây ra tổn thất kinh tế trực tiếp do làm giảm giá trị dinh dưỡng. 
• Đối với sản phẩm hoàn chỉnh, các thay đổi không chỉ làm giảm giá trị dinh dưỡng xuống dưới mức tiêu chuẩn tối thiểu mà còn ảnh hưởng đến độ ngon miệng và hình thức bên ngoài.

Do sự biến động theo mùa về nguồn cung và giá cả, việc duy trì lượng tồn kho lớn đối với nguyên liệu thô là cần thiết để đảm bảo đáp ứng nhu cầu liên tục với mức giá ổn định. 

Việc lưu trữ nguyên liệu nhập khẩu trong vòng 6 tháng là điều không hiếm gặp. Ở vùng nhiệt đới, thời gian lưu trữ kéo dài như vậy gây ra những vấn đề đặc biệt, bởi vì hai yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn nhất đến sự hư hỏng của thức ăn lưu trữ là nhiệt độ và độ ẩm tương đối. 

Tốc độ xảy ra các phản ứng hóa học thông thường sẽ tăng lên khi nhiệt độ môi trường tăng. Sự phát triển của côn trùng và nấm mốc cũng thuận lợi hơn trong điều kiện khí hậu nóng ẩm của vùng nhiệt đới. Ngoài ra, còn có mối quan hệ rõ rệt giữa hoạt động của côn trùng và các biến đổi hóa học trong thức ăn dự trữ. 

Trong bài này, chỉ cần lưu ý rằng để giảm thiểu sự hư hỏng của nguyên liệu và thức ăn thành phẩm trong quá trình lưu kho, cần phải giữ chúng ở điều kiện càng mát và khô càng tốt, đồng thời hạn chế sự xâm nhập của côn trùng và loài gặm nhấm. 

Do đó, nhà kho nên được xây dựng sao cho không gian bên trong luôn mát mẻ và khô ráo, có hệ thống thông gió phù hợp để giảm thiểu biến động vi khí hậu do sự hiện diện của nguyên vật liệu lưu trữ gây ra.

3. Phương pháp phân tích

3.1. Phân tích độ ẩm (Moisture)

Cân chính xác từ 4–5 g mẫu, đặt vào đĩa nhôm phẳng có nắp. Sấy đến khi đạt khối lượng không đổi ở nhiệt độ 100–105°C trong tủ sấy.

3.2. Phân tích đạm thô (Crude Protein) (Phương pháp Kjeldahl)

Hóa chất:

• (a) Axit sulfuric (98%), không chứa nitơ,
• (b) Kali sulfat, loại tinh khiết dùng cho phân tích,
• (c) Thủy ngân oxit (mercuric oxide), loại tinh khiết,
• (d) Sáp paraffin,
• (e) Natri hydroxit, dung dịch 40%,
  (f) Natri sunfua, dung dịch 4%,
• (g) Mảnh đá bọt (pumice chips),
• (h) Dung dịch axit boric/thuốc thử chỉ thị màu: Thêm 5 ml dung dịch chỉ thị màu (0.1% methyl đỏ và 0.2% bromocresol green trong cồn) vào 1 lít dung dịch axit boric bão hòa,
• (i) Dung dịch chuẩn axit hydrochloric (0.1N).

Dụng cụ:

• (a) Bộ thiết bị đun và chưng cất Kjeldahl loại lớn,
• (b) Bình Kjeldahl dung tích 500 ml hoặc lớn hơn,
• (c) Bình nón 250 ml.

Phương pháp:

Cân chính xác 1g mẫu vào bình phân hủy. Thêm 10g kali sulfat, 0.7 g thủy ngân oxit (có thể dùng viên xúc tác đã trộn sẵn hai chất này) và 20ml axit sulfuric. Đun nhẹ bình ở góc nghiêng cho đến khi hết sủi bọt, sau đó đun sôi cho đến khi dung dịch trong suốt. Tiếp tục đun thêm nửa giờ nữa. Nếu bọt nổi quá nhiều, có thể thêm một ít sáp paraffin.

Sau khi nguội, thêm khoảng 90 ml nước cất, để nguội lại, rồi thêm 25 ml dung dịch natri sunfua và trộn đều. Thêm một mảnh đá bọt để tránh trào, sau đó cho 80 ml dung dịch natri hydroxit vào, nghiêng bình để tạo thành hai lớp dung dịch. Nối nhanh vào bộ phận chưng cất, đun nóng và thu hơi amonia vào 50ml dung dịch axit boric đã pha chỉ thị. Thu được 50ml dịch chưng cất. Khi chưng cất xong, tháo bình nhận (rửa đầu ống ngưng tụ) và chuẩn độ với dung dịch axit tiêu chuẩn.

Tính toán:

Hàm lượng nitơ trong mẫu (%)

3.3. Phân tích chất béo thô (Crude Fat)

Hóa chất và thiết bị:

• (a) Dung môi ete dầu hỏa (nhiệt độ sôi 40–60°C),
• (b) Ống chiết (extraction thimbles),
• (c) Bộ chiết Soxhlet.

Phương pháp:

Cân chính xác 2–3 g mẫu đã sấy khô (có thể sử dụng phần cặn sau khi xác định chất khô) vào ống chiết. Đặt ống chiết vào bên trong bộ chiết Soxhlet. Nối bình dung môi đã được sấy khô và cân trước vào phía dưới thiết bị, thêm lượng dung môi cần thiết và kết nối với bộ ngưng tụ.

Điều chỉnh tốc độ đun để có tốc độ ngưng tụ từ 2 đến 3 giọt/giây và tiến hành chiết trong vòng 16 giờ. (Thời gian chiết có thể rút ngắn xuống tối thiểu 6 giờ nếu tăng tốc độ ngưng tụ.)

Sau khi chiết xong, tháo ống chiết ra và thu hồi ete bằng thiết bị. Sau đó, hoàn tất quá trình loại bỏ ete trên bếp cách thủy và sấy khô bình ở 105°C trong 30 phút. Để nguội trong bình hút ẩm và cân lại.

Tính toán:

Hàm lượng chất béo thô (% so với chất khô)

3.3.1. Phân tích axit béo tự do (Free fatty acids)

Hóa chất và thiết bị:

• (a) Cồn etylic (ethyl alcohol),
• (b) Phenolphthalein (dung dịch 1% trong cồn),
• (c) Natri hydroxit (0.25N),
  (d) Bình nón có nút đậy, dung tích 250 ml.

Phương pháp:

Cân một lượng dầu hoặc mỡ vào bình nón có nút. Thêm 50 ml cồn đã được trung hòa trước bằng cách cho lượng natri hydroxit 0.25N vừa đủ để tạo màu hồng nhạt với 2 ml dung dịch phenolphthalein.

Chuẩn độ mẫu với dung dịch natri hydroxit trong khi lắc mạnh cho đến khi xuất hiện màu hồng nhạt bền vững.

Tính toán:

Phần trăm axit béo tự do (tính theo axit oleic)

Lưu ý: Giữ lại mẫu sau khi chiết để phân tích xơ thô và chất béo đã chiết để xác định axit béo tự do.

3.4. Phân tích xơ thô (Crude Fibre)

Hóa chất:

• (a) Dung dịch axit sulfuric (0.25 N),
• (b) Dung dịch natri hydroxit (0.313 N),
• (c) Chất chống tạo bọt (rượu Octyl),
• (d) Cồn etylic,
• (e) Axit hydrochloric 1% (thể tích/thể tích).

Thiết bị:

• (a) Cốc thủy tinh 600 ml (thành cao),
• (b) Bộ ngưng tụ gắn với bình đáy tròn,
• (c) Bình lọc chân không (Buchner), dung tích 1 lít,
• (d) Phễu lọc Buchner (loại 3 phần Hartley),
• (e) Chén nung bằng silica có đáy xốp,
• (f) Vòng cao su phù hợp với chén nung ở trên.

Phương pháp:

Cân khoảng 2 g mẫu đã sấy khô và tách béo vào cốc 600 ml. Thêm 200ml dung dịch axit sulfuric nóng, đặt cốc dưới bộ ngưng tụ và đun sôi trong vòng 1 phút. Đun nhẹ nhàng chính xác trong 30 phút, dùng nước cất để duy trì thể tích và rửa các hạt dính vào thành cốc. Dùng chất chống tạo bọt nếu cần.

Lọc qua giấy lọc Whatman No. 541 trong phễu Buchner bằng hút chân không, rửa kỹ bằng nước sôi. Chuyển cặn trở lại cốc và thêm 200 ml dung dịch natri hydroxit nóng. Đặt lại dưới bộ ngưng tụ và đun sôi lại trong vòng 1 phút. Sau khi đun đúng 30 phút, lọc qua chén nung có đáy xốp và rửa bằng nước sôi, sau đó rửa bằng dung dịch axit hydrochloric 1%, rồi rửa lại bằng nước sôi.

Rửa hai lần bằng cồn, sấy khô qua đêm ở 100°C, để nguội và cân. Nung ở 500°C trong 3 giờ, để nguội và cân lại. Khối lượng xơ được tính bằng sai số khối lượng trước và sau khi nung.

Tính toán:

Hàm lượng xơ thô (% trên chất khô không béo)

3.5. Phân tích tro (Ash)

Cân 2 g mẫu cho vào một đĩa sứ khô đã được cân trước, sau đó đặt vào lò nung ở 600°C trong 6 giờ. Để nguội trong bình hút ẩm rồi cân lại.

Tính toán:

Tro (%)

3.5.1 Tro tan và không tan trong axit (Acid soluble and insoluble ash)

Thuốc thử và dụng cụ:

• (a) Axit hydrochloric (tỷ lệ 1:2,5 thể tích/thể tích),
• (b) Giấy lọc không tro,
• (c) Đĩa sứ.

Phương pháp:

Sử dụng phần cặn thu được từ phép xác định tro tổng. Đun sôi với 25 ml axit hydrochloric, cẩn thận tránh trào bắn. Lọc qua giấy lọc không tro và rửa bằng nước nóng cho đến khi hết axit. Cho giấy lọc và cặn vào đĩa sứ khô đã cân trước, rồi đặt vào lò nung ở 600°C trong 2 giờ hoặc cho đến khi không còn carbon.

Tính toán:

Tro không tan trong axit (%)

3.6. Xác định hàm lượng Canxi

Thuốc thử:

• (a) Axit hydrochloric (tỷ lệ pha loãng 1:3, thể tích/thể tích)
• (b) Axit nitric (nồng độ 70%)
• (c) Amoni hydroxit (tỷ lệ pha loãng 1:1, thể tích/thể tích)
• (d) Chỉ thị methyl đỏ (hòa tan 1 g vào 200 ml cồn)
• (e) Dung dịch amoni oxalat 4,2%
• (f) Axit sulfuric (nồng độ 98%)
• (g) Dung dịch chuẩn kali pemanganat (nồng độ 0,05 N)

Thiết bị và dụng cụ:

• (a) Đĩa sứ
• (b) Bình định mức 250 ml
• (c) Cốc thủy tinh 250 ml
• (d) Giấy lọc định lượng và phễu lọc
• (e) Buret để chuẩn độ

Phương pháp phân tích:

1. Chuẩn bị mẫu:

• Cân 2,5 g mẫu nghiền mịn vào đĩa sứ.
  Nung lấy tro (hoặc sử dụng cặn tro từ bước xác định tro tổng ở phần trước).

2. Hòa tan mẫu:

• Thêm 40 ml axit HCl và vài giọt axit HNO₃ vào cặn tro.
• Đun sôi hỗn hợp, để nguội.
• Chuyển dung dịch sang bình định mức 250 ml, pha loãng đến vạch và lắc đều.

3. Lấy mẫu phân tích:

• Dùng pipet lấy:
  • 100 ml nếu là thức ăn từ ngũ cốc
  • 25 ml nếu là thức ăn khoáng
• Cho vào cốc, pha loãng lên thành 100 ml bằng nước.

4. Điều chỉnh pH và tạo kết tủa:

• Thêm 2 giọt chỉ thị methyl đỏ.
• Nhỏ từng giọt dung dịch amoni hydroxit đến khi dung dịch có màu cam nâu nhạt.
• Thêm 2 giọt axit HCl để chuyển sang màu hồng.
• Thêm 50 ml nước, đun sôi.
• Trong khi khuấy, thêm 10 ml dung dịch amoni oxalat 4,2% đang nóng.
• Nếu cần, điều chỉnh pH bằng axit để duy trì màu hồng.

5. Lọc và chuẩn độ:

• Để kết tủa lắng xuống.
• Lọc kết tủa và rửa bằng dung dịch amoni hydroxit loãng (tỷ lệ 1:50).
• Cho giấy lọc chứa kết tủa vào lại cốc.
• Thêm 125 ml nước + 5 ml axit sulfuric.
• Đun nóng đến 70°C.
• Chuẩn độ bằng dung dịch kali pemanganat 0,05 N.

Tính toán:

Hàm lượng Canxi (%) được tính dựa trên thể tích dung dịch KMnO₄ đã dùng trong chuẩn độ

3.7. Xác định hàm lượng Phốt pho

Thuốc thử:

(a) Thuốc thử molybdo-vanadat:

• Hòa tan 40 g amoni molybdat (4H₂O) trong 400 ml nước nóng, để nguội.
• Hòa tan 2 g amoni metavanadat trong 250 ml nước nóng, để nguội, sau đó thêm 450 ml axit perchloric 70%.
• Từ từ thêm dung dịch molybdat vào dung dịch vanadat trong khi khuấy đều.
• Pha loãng toàn bộ dung dịch thành 2 lít.

(b) Dung dịch chuẩn phốt pho:

• Chuẩn bị dung dịch gốc bằng cách hòa tan 8,788 g kali dihydrogen orthophosphat (KH₂PO₄) trong nước và pha thành 1 lít.
• Pha dung dịch làm việc bằng cách pha loãng dung dịch gốc theo tỷ lệ 1:20 (nồng độ làm việc tương đương 0,1 mg P/ml).

Thiết bị:

• (a) Máy quang phổ (spectrophotometer) đo ở bước sóng 400 nm,
• (b) Bình định mức 100 ml.

Phương pháp:

1. Dùng pipet lấy một phần dung dịch mẫu (đã chuẩn bị như trong phần xác định canxi) cho vào bình định mức 100 ml.
2. Thêm 20 ml thuốc thử molybdo-vanadat.
3. Pha loãng đến vạch, lắc đều và để yên 10 phút.
4. Đồng thời, chuẩn bị các mẫu chuẩn chứa lần lượt 0,5 – 0,8 – 1,0 – 1,5 mg phốt pho bằng cách lấy một phần dung dịch chuẩn làm việc, cho vào bình 100 ml và xử lý tương tự như mẫu.
5. Đo độ hấp thụ (absorbance) của mẫu bằng máy quang phổ ở bước sóng 400 nm, sử dụng chuẩn 0,5 mg P để hiệu chỉnh tại 100% truyền sáng (transmission).
6. Từ đường chuẩn (được tạo từ các mẫu chuẩn), xác định lượng mg phốt pho có trong mỗi mẫu thử.

3.8. Sodium Chloride (NaCl)

Hóa chất:

• (a) Dung dịch bạc nitrat chuẩn 0,1 N,
• (b) Dung dịch amoni thiocyanat chuẩn 0,1 N,
• (c) Chỉ thị sắt – dung dịch bão hòa sắt nhôm trong nước,
• (d) Dung dịch kali permanganat – 6% (khối lượng/thể tích),
• (e) Dung dịch urê – 5% (khối lượng/thể tích),
• (f) Acetone (loại tinh khiết A.R.).

Phương pháp:

• Cân 2 g mẫu vào bình nón 250 ml. Làm ẩm mẫu bằng 20 ml nước, sau đó dùng pipet thêm 15 ml dung dịch bạc nitrat 0,1 N và trộn đều.
• Tiếp theo, thêm 20 ml axit nitric đậm đặc và 10 ml dung dịch kali permanganat, rồi trộn đều.
• Đun nóng hỗn hợp liên tục cho đến khi dung dịch trở nên trong và xuất hiện khói nitơ (nitrous fumes), sau đó để nguội.
• Thêm 10 ml dung dịch urê và để yên trong 10 phút.
• Tiếp tục thêm 10 ml acetone và 5 ml chỉ thị sắt, rồi chuẩn độ ngược lượng bạc nitrat dư bằng dung dịch thiocyanat 0,1 N cho đến khi xuất hiện màu nâu đỏ bền.

Tính toán:

Tính kết quả dưới dạng hàm lượng natri clorua (NaCl).

3.9. Phân Tích Rỉ Đường (Molasses)

3.9.1 Tổng hàm lượng đường (Total sugars)

Hóa chất:

(a) Dung dịch Fehling (biến thể Soxhlet)

• (i) Hòa tan 34,639 g đồng sunphat ngũ phân (CuSO₄·5H₂O) vào nước và pha loãng đến 500 ml. Lọc.
  (ii) Hòa tan 173 g kali natri tartrat (KNaC₄H₄O₆·4H₂O) và 50 g natri hydroxide vào nước, pha loãng đến 500 ml. Để yên trong hai ngày và lọc qua lớp amiăng chuẩn bị sẵn.

(b) Dung dịch chuẩn đường nghịch chuyển

Chuẩn bị dung dịch gốc bằng cách thêm 5 ml axit hydrochloric (tỷ trọng 1,18) vào 9,5 g sucrose đã hòa tan và pha loãng đến khoảng 100 ml. Để dung dịch ở nhiệt độ phòng trong 2 ngày, sau đó pha loãng đến 1 lít.

Chuẩn bị dung dịch làm việc (5 mg/ml) bằng cách lấy 100 ml dung dịch gốc cho vào bình định mức 200 ml, trung hòa bằng dung dịch natri hydroxide 20% (dùng phenolphthalein làm chỉ thị), sau đó pha loãng đến vạch và trộn đều.

• (c) Axit hydrochloric (tỷ trọng 1,18)
• (d) Axit hydrochloric 0,5 N
• (e) Natri hydroxide 20%
• (f) Chỉ thị phenolphthalein (1% trong cồn)
• (g) Chỉ thị xanh methylene (1% trong nước)

Thiết bị:

• (a) Bếp điện
• (b) Bình nón 300 ml

Phương pháp:

Hòa tan 8 g rỉ đường lỏng và pha loãng đến 500 ml. Thực hiện quá trình thủy phân bằng axit trên 100 ml dịch lọc bằng cách thêm 5 ml axit HCl (tỷ trọng 1,18) và để yên trong 24 giờ. Trung hòa bằng natri hydroxide 20% (dùng phenolphthalein làm chỉ thị), sau đó pha loãng đến 200 ml.

Chuẩn hóa dung dịch Soxhlet:

• Dùng pipet lấy 10 ml dung dịch Fehling (a) và (b), cho vào bình nón, thêm 30 ml nước.
• Thêm từ buret một lượng gần đủ dung dịch chuẩn để khử hoàn toàn đồng trong dung dịch Soxhlet.
• Đun sôi và giữ sôi trong 2 phút.
• Thêm 4 giọt xanh methylene và nhanh chóng hoàn tất chuẩn độ khi vẫn đang sôi, đến khi màu cam sáng xuất hiện trở lại. 
• Lặp lại nhiều lần để xác định chính xác thể tích cần thiết để khử hoàn toàn 20 ml dung dịch Soxhlet.

Chuẩn độ mẫu:

Đầu tiên tiến hành chuẩn độ sơ bộ: dùng pipet lấy 10 ml dung dịch (a) và (b) cho vào bình, thêm 10 ml mẫu, thêm 40 ml nước và đun sôi. Nếu màu xanh còn tồn tại, chuẩn độ bằng dung dịch chuẩn và tính toán sơ bộ hàm lượng đường trong mẫu.

Để xác định chính xác hàm lượng đường, dùng pipet lấy 10 ml dung dịch Soxhlet (a) và (b) cho vào bình nón và thêm một phần mẫu thích hợp. Thể tích mẫu dùng phụ thuộc vào hàm lượng đường của nó (xem Bảng 1).

Bảng 1. Thể tích mẫu được sử dụng trong chuẩn độ Soxhlet

(Trích từ Phương pháp phân tích chính thức của AOAC, 1970)

Thêm nước theo chỉ dẫn trong bảng, trộn đều và đun sôi. Trong khi đang sôi, thêm từ buret một lượng dung dịch chuẩn làm việc sao cho quá trình chuẩn độ gần như hoàn tất. Thêm chỉ thị xanh methylene và hoàn tất chuẩn độ.

Tính phần trăm đường (tính theo đường nghịch chuyển – invert sugar) theo công thức:

% sugar = (F – M) × 1 × 100/W

Trong đó:

• F: là thể tích dung dịch chuẩn cần thiết để khử hoàn toàn 20 ml dung dịch Soxhlet,
• M: là thể tích dung dịch chuẩn đường cần để hoàn tất chuẩn độ ngược,
• 1: là khối lượng đường nghịch chuyển có trong 1 ml dung dịch chuẩn làm việc,
• W: là khối lượng mẫu có trong phần mẫu (aliquot) được sử dụng.

3.9.2. Kali (Potassium)

Thuốc thử và thiết bị:

• (a) Axit hydrochloric (đậm đặc),
• (b) Dung dịch chuẩn kali

Để pha dung dịch chuẩn gốc (500 ppm K): Hòa tan 0,477 g kali clorua (loại tinh khiết phân tích – Analar) vào nước cất và pha thành 500 ml. Để pha dung dịch chuẩn làm việc (10 ppm): Pha loãng dung dịch chuẩn gốc theo tỷ lệ 1:50.

• (c) Chén nung bằng silica,
• (d) Máy đo quang phổ ngọn lửa (flame photometer),
• (e) Lò nung.

Phương pháp:

Cân 2 g mẫu cho vào chén nung silica, sấy ở 100°C để loại bỏ ẩm. Nhỏ vài giọt dầu ô liu tinh khiết vào và gia nhiệt trên ngọn lửa cho đến khi hiện tượng phồng ngừng lại. Đưa vào lò nung ở 500°C trong 24 giờ để tro hóa. Để nguội, sau đó thêm 2 ml axit hydrochloric đậm đặc để hòa tan cặn, rồi pha thành 100 ml.

Lấy 1 ml dung dịch này, tiếp tục pha loãng thêm đến 100 ml.

Hiệu chỉnh máy quang phổ ngọn lửa sao cho dung dịch chuẩn 10 ppm cho đọc số là 100. Sau đó, đo đọc mẫu. Nếu giá trị mẫu không nằm trong khoảng 50–100, cần pha loãng mẫu lại cho phù hợp để có kết quả chính xác.

3.10. Chất kháng chuyển hóa và độc tố trong thức ăn chăn nuôi (Anti-metabolite and Toxins in Feeds)

3.10.1 Hoạt tính urease trong khô dầu đậu nành (Urease activity in soybean meal)

Thuốc thử:

• (a) Dung dịch dimethylaminobenzaldehyde (DMAB):

Hòa tan 16 g DMAB trong 1 lít cồn etylic 95%, sau đó thêm 100 ml axit hydrochloric đậm đặc. Dung dịch này ổn định trong vòng 1 tháng.

• (b) Dung dịch đệm pyrophosphate:

Hòa tan 23,3 g Na₄P₂O₇ trong khoảng 980 ml nước cất. Thêm 3 ml HCl đậm đặc, rồi điều chỉnh thêm HCl đến khi pH đạt khoảng 7,7–7,8. Pha loãng thành 1 lít.

• (c) Dung dịch ure đệm:

Hòa tan 0,4 g ure trong 1 lít dung dịch đệm pyrophosphate. Dung dịch ổn định trong 1 tuần.

• (d) Dung dịch kẽm axetat:

Hòa tan 22 g kẽm axetat (Zn(CH₃COO)₂·2H₂O) trong nước cất, thêm 3 ml axit axetic băng và pha loãng thành 100 ml.

• (e) Dung dịch kali ferroxyanua:

Hòa tan 10,6 g K₄Fe(CN)₆·3H₂O trong nước cất và pha loãng thành 100 ml.

• (f) Than hoạt tính.

Thiết bị:

• (a) Bể cách thủy ở 40°C (duy trì nhiệt độ ±1°C) có bộ lắc,
• (b) Bình tam giác 125 ml,
• (c) Bình định mức 25 ml,
• (d) Máy quang phổ (spectrophotometer).

Phương pháp:

• Cân chính xác 1 g khô dầu đậu nành cho vào bình tam giác, thêm 50 ml dung dịch ure đệm.
• Ủ trong bể cách thủy ở 40°C trong chính xác 30 phút với lắc đều.
• Lấy ra khỏi bể và nhanh chóng thêm mỗi loại 0,5 ml: HCl đậm đặc, dung dịch ferroxyanua, dung dịch kẽm axetat và 0,1 g than hoạt tính.
  Lắc trong 15 phút rồi lọc. Nếu dịch lọc còn màu, lặp lại với nhiều than hoạt tính hơn.
• Lấy 10 ml dịch lọc, trộn với 10 ml dung dịch DMAB vào bình định mức 25 ml, pha loãng đến vạch bằng nước cất.
• Chuẩn bị mẫu trắng thuốc thử: 10 ml DMAB pha đến 25 ml bằng nước.
• Chuẩn bị mẫu trắng ure: 10 ml dung dịch ure đệm + 10 ml DMAB, pha đến 25 ml bằng nước.
• Tạo đường chuẩn bằng cách lấy các thể tích từ 2–12 ml dung dịch ure đệm vào các bình định mức 25 ml, thêm 10 ml DMAB và pha đến vạch.
• Trộn đều, để các bình trong bể nước ở 25°C trong 10 phút, sau đó đọc độ hấp thụ ở bước sóng 430 nm.

3.10.2 Gossypol tự do trong khô dầu hạt bông (Free gossypol in cottonseed meal)

Có hai quy trình được mô tả để xác định gossypol tự do:

• Quy trình thứ nhất áp dụng cho các loại khô dầu thông thường.
• Quy trình thứ hai dành cho khô dầu đã được xử lý hóa học, có chứa dianilinogossypol.

Thuốc thử:

• (a) Dung dịch acetone-nước: 7 phần acetone, 3 phần nước cất (tính theo thể tích).
• (b) Dung dịch acetone-nước-anilin:

Trộn 700 ml acetone + 300 ml nước cất, sau đó thêm 0,5 ml anilin đã cất lại. Chuẩn bị hàng ngày.

• (c) Dung dịch isopropanol-nước: 8 phần isopropanol, 2 phần nước cất (v/v).
• (d) Anilin:

Cất lại anilin loại tinh khiết trong sự hiện diện của một lượng nhỏ bụi kẽm. Loại bỏ 10% đầu và 10% cuối của dịch cất. Bảo quản trong chai thủy tinh nâu có nút kín, giữ lạnh. Ổn định trong vài tháng. 

• (e) Dung dịch gossypol chuẩn:

(i) Hòa tan 25 mg gossypol tinh khiết trong acetone không chứa anilin, chuyển vào bình định mức 250 ml cùng 100 ml acetone. Thêm 75 ml nước cất và pha loãng đến vạch bằng acetone, lắc đều.

(ii) Lấy 50 ml dung dịch (i), thêm 100 ml acetone tinh khiết, 60 ml nước cất, và pha loãng đến 250 ml bằng acetone. Dung dịch (ii) chứa 0,02 mg gossypol/ml, ổn định trong 24 giờ trong bóng tối.

Thiết bị:

• (a) Máy lắc cơ học,
  (b) Máy quang phổ,
• (c) Bình tam giác 250 ml,
• (d) Bình định mức 25 ml và 250 ml,
• (e) Bể cách thủy sôi.

Phương pháp:

Nghiền mẫu sao cho lọt qua rây 1 mm, tránh để nóng quá. Lấy khoảng 1 g mẫu, thêm 25 ml acetone tinh khiết, khuấy vài phút rồi lọc. Chia dịch lọc thành hai phần. Thêm một viên natri hydroxit vào một phần và đun nóng trong bồn nước trong vài phút. 

• Nếu dung dịch có màu vàng nhạt và không đổi màu khi thêm NaOH → dùng quy trình (1).
• Nếu xuất hiện màu đỏ cam đậm → chứa dianilinogossypol → dùng quy trình (2).

Quy trình (1) – Gossypol tự do (không xử lý hóa học):

1. Cân từ 0,5 đến 1 g mẫu (tùy theo hàm lượng gossypol dự kiến) vào bình tam giác.
2. Thêm các hạt thủy tinh, pipet 50 ml dung dịch acetone-nước, đậy nắp, lắc trong 1 giờ.
3. Lọc, bỏ đi vài ml đầu tiên. Pipet 2 mẫu giống nhau (2–10 ml tùy hàm lượng) vào bình định mức 25 ml.
   • Mẫu a: Pha loãng đến vạch bằng dung dịch isopropanol-nước.
   • Mẫu b: Thêm 2 ml anilin đã cất lại, đun cách thủy sôi 30 phút cùng với mẫu trắng thuốc thử (2 ml anilin + dung dịch acetone-nước bằng thể tích mẫu).
4. Sau khi đun, lấy ra, thêm dung dịch isopropanol-nước để hòa tan hoàn toàn, làm nguội đến nhiệt độ phòng. Pha loãng đến vạch bằng isopropanol-nước.

• Đo độ hấp thụ (Absorbance) ở 400 nm.
  • Đặt Abs = 0 với dung dịch isopropanol-nước.
  • Xác định độ hấp thụ của mẫu a và mẫu trắng. Nếu mẫu trắng > 0.022 → dùng lại anilin mới.
  • Đo độ hấp thụ mẫu b, trừ đi mẫu a để có Abs hiệu chỉnh.

Tính mg gossypol tự do dựa trên đường chuẩn (chuẩn bị bên dưới).

Quy trình (2) – Mẫu đã xử lý hóa học (có dianilinogossypol):

1. Cân 1g mẫu, thêm 50 ml dung dịch acetone-nước, lắc, lọc.
2. Pipet 2 mẫu giống nhau (2–5 ml) vào bình 25 ml:
   • Mẫu a: pha đến vạch với dung dịch isopropanol-nước, để yên ít nhất 30 phút rồi đo hấp thụ.
   • Mẫu b: xử lý giống quy trình (1), đo hấp thụ.
3. Dùng đường chuẩn để xác định lượng gossypol biểu kiến trong cả hai dung dịch.

Chuẩn bị đường chuẩn:

1. Pipet 1, 2, 3, 4, 5, 7, 8, 10 ml dung dịch gossypol chuẩn (0.02 mg/ml) vào các bình định mức 25 ml.
2. Một nửa (mẫu a): pha loãng với dung dịch isopropanol-nước → đo hấp thụ.
3. Nửa còn lại (mẫu b): thêm 2 ml anilin đã cất lại, đun như trên. Chuẩn bị thêm một mẫu trắng (2 ml anilin + 10 ml acetone-nước), đun cùng các mẫu.
4. Tính hệ số hấp thụ hiệu chỉnh: Abs hiệu chỉnh = Abs (b) – Abs (a)
5. Vẽ đường chuẩn: trục tung là Abs hiệu chỉnh, trục hoành là lượng gossypol (mg) trong 25 ml.

Tính phần trăm gossypol tự do trong các bữa ăn thông thường như sau:

Trong đó:

• G – là giá trị đọc của đồ thị
• W – khối lượng mẫu
• V – thể tích phần mẫu được sử dụng

Đối với các thức ăn được xử lý bằng hóa chất:

Trong đó:

• A – mg gossypol tự do biểu kiến ​​trong phần mẫu (a)
• B – mg gossypol tự do biểu kiến ​​trong phần mẫu (b)
• W – khối lượng mẫu
• V – thể tích phần mẫu được sử dụng

3.10.3 Xác định Thioglucoside (Thioglucoside determination)

Phương pháp mô tả dưới đây cho phép xác định hàm lượng thioglucoside ước tính, nhưng không phân biệt được từng loại thioglucoside hay isothiocyanate riêng lẻ.

Thuốc thử và thiết bị:

• (a) Bari clorua (dung dịch 5%)
• (b) Bình định mức 600 ml
• (c) Bếp hấp cách thủy (hơi nước)

Phương pháp:

1. Cân 10 g khô dầu (đã tách béo bằng phương pháp chiết Soxhlet), cho vào bình.
2. Thêm 250 ml nước cất, thủy phân ở 54°C trong 1 giờ, sau đó đun sôi trong 2 giờ, giữ thể tích không đổi.
3. Lọc, giữ lại dịch lọc, rửa phần cặn 3 lần, mỗi lần với 50 ml nước nóng.
4. Gộp dịch rửa vào dịch lọc ban đầu, sau đó pha loãng đến 600 ml.
5. Kết tủa bari sulfat bằng cách đun nóng dung dịch và thêm dư dung dịch bari clorua.
6. Để hỗn hợp trên bếp hấp cách thủy vài giờ, sau đó lọc lấy kết tủa.
7. Tôi tro (nung) kết tủa trong lò nung (muffle furnace), sau đó cân phần tro thu được.

Tính toán:

Tính hàm lượng thioglucoside gần đúng như sau:

3.10.4 Phân tích Aflatoxin (Aflatoxin analysis)

Dưới đây là phương pháp phân tích aflatoxin, thích hợp cho các nguyên liệu như khô dầu lạc, khô dầu dừa, và khô dầu cọ. Để biết chi tiết đầy đủ của phương pháp và các quy trình thay thế, tham khảo tài liệu “Methods of Aflatoxin Analysis” của B. D. Jones (1972), Report No. G70, Tropical Products Institute, London.

Thuốc thử:

• (a) Chloroform (cấp phân tích)
• (b) Diethyl ether (cấp phân tích)
• (c) Hỗn hợp chloroform/methanol (tỉ lệ 95/5, thể tích/thể tích)
• (d) “Celite”, đất tảo cát
• (e) Kieselgel ‘G’ (hãng Merck)
• (f) Tiêu chuẩn định tính

Giúp phân biệt vết aflatoxin với các vết huỳnh quang khác có thể có trong mẫu. Có thể sử dụng khô dầu lạc chứa aflatoxin B, có sẵn tại Tropical Products Institute, London.

Thiết bị:

• (a) Bản sắc ký lớp mỏng (TLC), kích thước 20 x 20 cm
• (b) Đèn UV, bước sóng cực đại tại 365 nm
• (c) Chai miệng rộng 250 ml
• (d) Micropipette
• (e) Thiết bị lắc dung dịch

Phương pháp:

1. Cân 10 g mẫu, cho vào chai miệng rộng, trộn đều với 10 ml nước.
   (Nếu mẫu có hàm lượng chất béo cao, cần chiết sơ bộ bằng Soxhlet với ether dầu mỏ.)
2. Thêm 100 ml chloroform, đậy nắp kín bằng nút không phản ứng với chloroform, lắc trong 30 phút.
   Lọc qua “Celite”, lấy 20 ml dịch lọc, pha loãng lên 25 ml → Dung dịch a.

Lấy tiếp 20 ml dịch lọc, cô đặc xuống còn 5 ml → Dung dịch b.

Chuẩn bị bản sắc ký:

1. Lắc 100 g Kieselgel ‘G’ với 220 ml nước trong 20 phút.
2. Tráng hỗn hợp lên bản TLC bằng dụng cụ chuyên dụng, độ dày lớp khoảng 0.5 mm.
3. Để yên 1 giờ, sau đó sấy ở 100°C.

Chạy sắc ký:

• Chấm lên bản TLC:
  • 10 và 20 µl dung dịch b
  • 5 và 10 µl dung dịch a
  • 1 điểm mẫu chuẩn
    (Tất cả chấm cách đáy bản 2 cm, cách mép mỗi bên ít nhất 2 cm, thực hiện dưới ánh sáng yếu.)
• Phát triển bản TLC trong diethyl ether, đến độ cao 12 cm, để khô trong ánh sáng yếu.
• Sau đó, phát triển tiếp bằng chloroform/methanol (95/5, v/v) đến độ cao 10 cm tính từ vạch gốc.

Phân tích:

• Kiểm tra bản TLC trong phòng tối, cách đèn UV 30 cm.
• Vết huỳnh quang xanh lam tại Rf = 0.5 – 0.55 → cho thấy có mặt aflatoxin B
  (đối chiếu với vết chuẩn để xác nhận)
• Vết thứ hai tại Rf = 0.45 – 0.5 → cho thấy có mặt aflatoxin G
• Mức độ độc của mẫu được phân loại theo sự hiện diện và cường độ của aflatoxin B và G, theo Bảng 2 (trong tài liệu gốc).

Bảng 2 Mức độ độc tính của Alatoxin B và G

4. Tài liệu tham khảo

Cockerell, I. và D. Holliday, 1975 Kiểm soát chất lượng trong ngành sản xuất thức ăn chăn nuôi. Trop.Prod.Inst.Rep., (G97)

Jones, B.D. 1972, Phương pháp phân tích aflatoxin. Trop.Prod.Inst.Rep., (G70)

Nguồn: FAO